Las interacciones de acridinas monoméricas y bisacridinas (UA) asimétricas con dúplex de ADN: una visión proporcionada por estudios de RMN y MD

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3431 (2023) Citar este artículo

894 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Los miembros de una nueva clase de compuestos anticancerígenos que exhiben una alta actividad antitumoral, es decir, las bisacridinas (UA) asimétricas, constan de dos sistemas de anillos heteroaromáticos. Uno de los sistemas de anillos es un resto de imidazoacridinona, con el esqueleto idéntico a la base estructural de Symadex. El segundo es un resto 1-nitroacridina, por lo que puede considerarse la base estructural de la nitracrina. Estas unidades de monoacridina están conectadas por un conector aminoalquilo, que varía en estructura. En teoría, estos dímeros asimétricos deberían actuar como bis-intercaladores de ADN bicatenario (ADNds), ya que anteriormente se informó que las unidades monoméricas que constituyen los UA exhiben un modo intercalado de unión al ADNds. Por el contrario, nuestros estudios preliminares anteriores han sugerido que la unión específica y/o estructuralmente bien definida de UA en dúplex de ADN podría no ser el caso. En esta contribución, hemos revisado y examinado cuidadosamente las propiedades de unión al ADNbc de las monoacridinas C-1305, C-1311 (Symadex), C-283 (Ledakrin/Nitracrine) y C-1748, así como de las bisacridinas C-2028, C -2041, C-2045 y C-2053 utilizando técnicas avanzadas de RMN, asistidas por cálculos de modelado molecular y el análisis de espectros UV-VIS, descompuestos mediante técnicas quimiométricas. Estos estudios nos permitieron explicar por qué las propiedades de los AU no son una simple suma de las características exhibidas por los monómeros de acridina.

Recientemente se sintetizó y fue objeto de numerosos estudios1 una nueva clase de agentes anticancerígenos, es decir, las bisacridinas asimétricas (UA). Mostraron una alta actividad antitumoral contra más de una docena de líneas celulares cancerosas probadas, así como actividad antitumoral contra el adenocarcinoma de rata Walker 256 y diez xenoinjertos de tumores humanos en ratones desnudos. En particular, los compuestos que mostraron la mayor actividad inhibieron fuertemente las líneas celulares de cáncer de páncreas1. Los estudios sobre los efectos biológicos de estos compuestos demostraron su capacidad para suprimir el crecimiento de esferoides cancerosos en 3D2. Además, su actividad anticancerígena mejoró cuando se unieron a puntos cuánticos cuaternarios, lo que resultó en una regulación positiva selectiva de su captación celular3.

Los fundamentos moleculares de la actividad biológica de los AU, así como sus posibles objetivos moleculares, aún se investigan exhaustivamente. Hasta donde sabemos, los UA son compuestos altamente citotóxicos con valores de CI50 en el rango de ng/ml, aunque la sensibilidad de las líneas celulares individuales a los compuestos varía. Resultados anteriores establecieron que las células tratadas con AU sufren apoptosis o senescencia4. Se ha demostrado que los AU ingresan rápidamente a la célula, ya que se detectan en las células tan pronto como 1 hora después del tratamiento3 (algunos resultados no están publicados). Sin embargo, el grado en que los UA se retienen en la célula después de su entrada es marcadamente diferente para las distintas líneas celulares. La determinación dependiente del tiempo de la concentración de UA después de una incubación prolongada revela una concentración aumentada, disminuida o constante de UA en las células3. Además, se ha observado una localización de UA en la célula dependiente del pH, ya que la concentración de UA aumentó en orgánulos caracterizados por un pH bajo, como los lisosomas y los endosomas3,5.

Los miembros del grupo UA comparten una característica estructural común: constan de dos sistemas de anillos heteroaromáticos, que son esencialmente derivados de acridina. Uno de los sistemas de anillos es un resto imidazoacridinona, con el esqueleto idéntico a la base estructural de C-1311 (Symadex)1,6. El segundo es un resto 1-nitroacridina, opcionalmente con un sustituyente metilo en la posición para en relación con la función –NO2. Por lo tanto, se puede considerar que tiene una base estructural de C-283 (Ledakrin/Nitracrine) o C-1748. Estas unidades de monoacridina están conectadas por un conector aminoalquilo, que varía en estructura (Fig. 1). Dado que las moléculas de AU contienen numerosos sitios potenciales de protonación, las propiedades fisicoquímicas y la actividad antitumoral resultante de estos compuestos podrían depender en gran medida del pH del medio ambiente, lo que fue demostrado inequívocamente en nuestro informe anterior6.

Las estructuras de los compuestos examinados.

Estudios anteriores han sugerido firmemente que C-283, C-1311 (Symadex) y C-1748 son los intercaladores de ADN bicatenario (ds)7,8,9,10,11,12. Recientemente, hemos informado que Symadex es un intercalador de ADNbc eficiente con preferencia a los pasos de dinucleótido AG/CT o GA/TC11,12. Los siguientes estudios sobre su análogo, la triazoloacridinona C-1305, han demostrado que este último compuesto exhibe una notable especificidad de secuencia, siendo el paso dinucleótido TA/TA el sitio de unión preferido dentro del ADN bicatenario13. Basándonos en estos resultados y otros hallazgos recientes14,15,16, también hemos sugerido que la secuencia TA/TA podría actuar como un sitio de unión preferido para muchos intercaladores de ADN, al menos para los basados en acridina y aquellos que no presentan requisitos estereoquímicos específicos mientras se une al dsDNA. La cavidad de unión TA/TA no se había considerado previamente en el caso de la imidazoacridinona C-1311, mientras que la unión de C-283 y C-1748 a los ácidos nucleicos nunca se examinó mediante espectroscopia de RMN, ni estructuralmente ni en cuanto a una secuencia potencial. -especificidad de estos fármacos.

Se podría esperar que las estructuras que constan de dos sistemas de anillos basados en acridina también fueran excelentes agentes de unión al ADNbc. Por el contrario, nuestros estudios previos han sugerido que, sorprendentemente, las bisacridinas (UA) asimétricas no interactúan con los dúplex de ADN1. Teniendo en cuenta todo lo anterior, en esta contribución hemos presentado estudios detallados basados en RMN y UV-VIS sobre C-1305, C-1311, C-283 y C-1748, así como UA, que se unen a varias secuencias de doble -ADN hebrado. En este sentido, el objetivo de nuestros estudios fue profundizar en las propiedades de los monómeros de acridina antes mencionados para discutir por qué las características exhibidas por las bisacridinas asimétricas están lejos de ser una simple suma de propiedades mostradas por las unidades monoméricas.

Los dúplex palindrómicos (denominados en lo sucesivo D1 a D9), examinados en presencia de los derivados monoméricos de acridina, se presentaron en la Tabla 1. Esas secuencias (combinadas) incluían los 10 posibles pasos de dinucleótidos que ocurren en el ADN bicatenario y eran idénticas a los diseñados para estudios sobre C-130513. La interpretación de los espectros de RMN 1H resultantes se basó en los mismos supuestos presentados en nuestro trabajo anterior13.

Para: (1) suprimir la tendencia de las monoacridinas a autoasociarse en soluciones acuosas; y para (2) asegurar una fracción molar más alta posible de una única forma espectral de un ligando dado dentro de la sonda mientras interactúa con los ácidos nucleicos, todos los estudios siguientes se realizaron en tampón cacodilato a pH = 5,0 con una concentración baja de NaCl (10 mM ). En estas condiciones, los palíndromos de ADNds examinados (Tabla 1) mantuvieron conformaciones estándar de ADN-A (D3, D6, D717,18) o ADN-B (el resto), mientras que en el caso de las monoacridinas estudiadas su forma espectral dominante en un La solución era un monómero cargado positivamente (excluyendo C-1748, que no contiene ninguna carga en estas condiciones). En particular, D6 requirió una concentración más alta de NaCl (50 mM) para asumir una conformación de doble hélice en una solución.

Nuestras evaluaciones de 1H NMR para C-1311, que se mostraron parcialmente en la Fig. 2, han evidenciado claramente que Symadex, de hecho, prefiere el sitio de unión TA/TA a los pasos de dinucleótido AG/TC y GA/CT previamente postulados11,12 (Fig. 2A–F). Teniendo en cuenta los datos recopilados para todas las secuencias examinadas en el presente documento, la especificidad de secuencia de C-1311 se estableció como TA/TA >> CG/CG. Aunque no se pudo observar de manera directa una intercalación específica de Symadex en el paso TG/CA, el patrón de unión preferido de 5′-pirimidina-purina-3' todavía era visible en el caso de C-1311, al igual que para la triazoloacridinona. C-130513. Además, no pudimos observar una unión específica de Symadex a los sitios AG/CT y GA/TC durante nuestros exámenes. Si bien este hecho podría estar asociado con la alteración de las condiciones experimentales en comparación con nuestros estudios anteriores11,12, la razón principal parecía ser la presencia de las mejores opciones (TA/TA o CG/CG), que no estaban ubicadas en el Extremos de las secuencias palindrómicas.

Espectros de 1H RMN ejemplares de: dúplex D2 libre (A); D2 dúplex interactuando con C-1311 (B); D2 dúplex interactuando con C-283 (C); D2 dúplex interactuando con C-1748 (D); dúplex D3 libre (E); D3 dúplex interactuando con C-1311 (F); dúplex D9 libre (G); D9 dúplex interactuando con C-1311 (H); dúplex D4 libre (I); D4 dúplex interactuando con C-283 (J); D4 dúplex interactuando con C-1748 (K). Para obtener la explicación de los nombres en clave de los dúplex, consulte la Tabla 1. En todos los casos, la estequiometría de los complejos examinados fue dsDNA/ligando 1:1,5 mol/mol. Los asteriscos rojos marcan los protones imino de los dúplex de ADNbc libres restantes.

Dos de los aductos no covalentes estudiados, d(CGATATCG)2:C-1311 (D2L) y d(CCCTAGGG)2:C-1311 (D3L), fueron seleccionados para estudios detallados de RMN 2D para una comparación directa con los reportados previamente. Complejos d(CGATATCG)2:C-1305 yd(CCCTAGGG)2:C-1305. Además, las constantes de disociación de C-1311 a los pasos palindrómicos del tetranucleótido NTAN (donde N significa nucleótidos C/G/A/T) se evaluaron mediante espectroscopía UV-VIS. Los resultados de estos estudios se discutieron en capítulos separados.

Se examinaron los mismos octámeros palindrómicos D1-D9 en presencia de C-283 y C-1748 (Tabla 1). Desafortunadamente, las resonancias de los protones imino T/G, que efectivamente desaparecieron tras la adición de ligandos de nitroacridina (Fig. 2C, D, J, K), apuntaron a interacciones inespecíficas ADN/ligando. Si bien en el caso de C-1311 un nuevo conjunto de resonancias imino del ADN fue un testimonio de la formación de un complejo de intercalación (Fig. 2A, B, E, F), no se observó tal fenómeno en presencia de C-1311. -283 ni C-1748 para ninguno de los dúplex estudiados. Por lo tanto, teniendo en cuenta la evidente ampliación de las resonancias de los protones aromáticos H5/H6/H8 de los dúplex D1-D9 (sin que surjan nuevas resonancias de ADN, lo que sugeriría la presencia de un aducto ADN:ligando definido estereoquímicamente, Fig. 2C,D,I–K) y considerando el hecho de que, en esta etapa, el paso del dinucleótido TA/TA debe considerarse como un sitio de unión predeterminado de los intercaladores basados en acridina, se debe concluir que las nitroacridinas estudiadas, aunque interactúen de manera inespecífica con ADN—no son los intercaladores de ADNbc más eficientes, lo que contradice el paradigma actual7,8,9,10,19,20.

Para obtener una visión más profunda de las interacciones dsDNA:nitroacridina, además hemos realizado experimentos de titulación, utilizando el palíndromo d(CGATATCG)2 (D2) como huésped de ADN. Tras la adición de C-283 (Nitracrina, ver Fig. S10A en los Datos complementarios), se observó la desaparición urgente de las resonancias imino T4 y T6, mientras que las resonancias imino protónicas G2 y G8 permanecieron básicamente sin cambios, hasta que el ADN:C- Se alcanzó una estequiometría de la solución de 283 1:1 mol/mol. Asimismo, los protones aromáticos A3H2 y A5H2 se fueron ensanchando paulatinamente, así como T4H6 y T6H6; y resonancias T4CH3 y T6CH3. Cabe destacar que el resto de las resonancias sólo se desplazaron ligeramente o, en la mayoría de los casos, permanecieron inalteradas. La adición adicional del ligando, para superar la estequiometría 1:1, dio como resultado una imagen similar a la de la figura 2C.

Dado que todos los protones antes mencionados están ubicados en la región central de la hélice D2, los experimentos de titulación han demostrado que C-283 interactuó con D2 en el centro del octámero estudiado, cerca de una posible cavidad de unión TA/TA. Sin embargo, como no observamos la aparición de un nuevo conjunto de resonancias de ADN, sólo el ensanchamiento de algunas de ellas (mientras que las resonancias de ligando en sí se ampliaron más allá de la detección), la formación (y disociación) del complejo ADN:ligando debe ocurrir en el régimen de intercambio rápido a intermedio en la escala de tiempo del cambio químico. Como toda nuestra experiencia previa con la unión intercalada de derivados de acridina al ADN13 sugiere tiempos de vida complejos dentro del régimen de intercambio lento, interpretamos tal resultado como un efecto de un modo de interacción más superficial y quizás menos definido espacialmente, presumiblemente con el surco menor del ADN. . Cabe señalar que no se puede excluir el modo de acción de intercalación de la nitracrina; Además, la aparente ampliación de las resonancias de timina metilo sugiere que es posible que se produzca el evento de intercalación. Sin embargo, incluso si esto ocurre, la estabilidad de los complejos de intercalación dsDNA:C-283 resultantes es de órdenes de magnitud menor en comparación con los complejos formados por imidazoacridinonas y triazoloacridinonas, es decir, C-1311 y C-1305.

En el caso de los experimentos de titulación D2:C-1748, al final, las resonancias imino T4 y T6 se debilitaron notablemente (aunque aún son observables y nítidas), mientras que las resonancias A3H2, A5H2, T4H6, T6H6, T4CH3 y T6CH3 se ampliaron ligeramente. (Figura S10B). El resto de resonancias se mantuvieron inalteradas. Estos resultados han sugerido un modo de interacciones ADN:ligando similar al propuesto para C-283, aunque la nitroacridina C-1748 mostró una afinidad mucho menos pronunciada por el palíndromo D2.

Las evaluaciones de 1H NMR han indicado que la imidazoacridinona C-1311 (Symadex) formó aductos no covalentes 1:1 mol/mol muy bien definidos con palíndromos d(CGATATCG)2 (D2) y d(CCCTAGGG)2 (D3) (Fig. 2A, B, E, F, Tabla 1). Dado que se eligieron los mismos octámeros para estudios estructurales en complejos formados por triazoloacridinona C-130513, hemos decidido comparar directamente las características estereoquímicas de los aductos resultantes con los informados anteriormente.

Los complejos formados por Symadex fueron examinados en las mismas condiciones experimentales que los aductos formados por C-1305, por lo que las asignaciones de las resonancias de los palíndromos D2 y D3 libres de ligando se tomaron de nuestro estudio anterior13. Las asignaciones a los protones de los sistemas D2L y D3L se enumeraron en los Datos complementarios (Tabla S1, Fig. S4).

Un examen exhaustivo de los espectros NOESY (Figs. S1 y S2) permitió una ubicación inequívoca del ligando entre los restos T4 y A5 en el caso de ambos complejos estudiados. Esto fue posible gracias a conjuntos extensos de NOE de ADN/C-1311 observados, enumerados en la Tabla 2. Estos NOE se tradujeron posteriormente en parámetros de entrada para cálculos de dinámica molecular (MD), donde sirvieron como restricciones de distancia. Las trayectorias MD resultantes finalmente se sometieron a un análisis de conglomerados para buscar las estructuras más representativas de cada aducto de ADN/ligando, que se muestran en la Fig. 3.

(A) La estructura de la cavidad de unión 5′-ATAT-3' con la molécula de ligando incrustada, es decir, el fragmento central del complejo d(CGATATCG)2:C-1311 (D2L). (B) La estructura de la cavidad de unión 5′-CTAG-3' con la molécula de ligando incrustada, es decir, el fragmento central del complejo d(CCCTAGGG)2:C-1311 (D3L). Los NOE de ADN/ligando seleccionados se representaron como flechas bidireccionales rojas, junto con los números respectivos correspondientes a las correlaciones enumeradas en la Tabla 2.

Como se informó anteriormente11,12, Symadex se intercaló en el surco menor de los palíndromos de ADNbc. El grupo hidroxilo del ligando, ubicado en la posición 8, era propenso a formar un enlace de hidrógeno con el átomo de oxígeno O4' perteneciente al resto de desoxirribosa A5 de una de las cadenas de ADNbc, lo que aumentó la estabilidad del complejo resultante. Este enlace de hidrógeno existió durante el 82,2% del tiempo de simulación en el caso del aducto D2L y durante el 85,3% en el caso del conjunto D3L. En particular, durante el tiempo de simulación, la cadena lateral de aminoalquilo del ligando, aunque cargada positivamente, no mostró ninguna conformación particular preferida dentro del surco menor del ADN en el caso de los dos sistemas considerados. Esta observación, si bien es resultado de los cálculos de MD, en realidad tenía una base espectroscópica sólida: no se registraron NOE entre la cadena lateral de C-1311 y los protones del ADN en los espectros NOESY de ninguno de los complejos (Tabla 2). Esta fue una diferencia importante en comparación con los estudios anteriores sobre C-1305, donde su cadena lateral se alineaba a lo largo de la columna vertebral de azúcar-fosfato del ADN, cambiando ocasionalmente su orientación entre paralela y antiparalela a una cadena de ADN determinada. Esas conclusiones fueron fuertemente respaldadas por los NOEs de ADN/cadena lateral observados13.

Nuestros estudios anteriores sobre C-1305 han demostrado que la especificidad de secuencia de la unión de este fármaco al ADNds mediante intercalación debe considerarse en pasos de tetranucleótidos13. Las evaluaciones de RMN han sugerido que se prefirió el sitio de unión de CTAG a las secuencias GTAC y ATAT, mientras que no se establecieron los valores exactos de las constantes de disociación de C-1305 de varios sitios NTAN13. La especificidad del tetranucleótido dsDNA también se confirmó en el caso de C-1311, aunque los espectros de RMN registrados han sugerido fuertemente sus preferencias notablemente diferentes en ese sentido (ATAT > CTAG, GTAC). Para cuantificar estas preferencias, es decir, en forma de constantes de disociación, hemos diseñado cuatro octámeros de ADN palindrómico adicionales, B1-B4, que contienen todos los pasos posibles de tetranucleótidos NTAN con pares de bases CG/CG flanqueantes idénticos (Tabla 3).

La afinidad de unión al ADN se estimó mediante espectroscopia UV-VIS. Un análisis quimiométrico exhaustivo de los espectros resultantes ha indicado que C-1311 interactuó con todas las secuencias estudiadas, aunque las afinidades de unión fueron considerablemente diferentes dentro del conjunto estudiado de oligómeros de ADNbc. La unión más débil del ligando, es decir, la constante de disociación más alta del complejo, se ha observado en el caso del octámero d(CGGTACCG)2 (B1), mientras que su interacción con d(CGCTAGCG)2 (B2) y (CGATATCG)2 ( B3) fue relativamente fuerte, aunque la constante de disociación de B3 fue notablemente menor que la calculada para B2. Curiosamente, las interacciones ADN/ligando más fuertes se produjeron en el caso del palíndromo d(CGTTAACG)2 (B4), aunque el valor de la constante de disociación B4:C-1311 simplemente se evaluó, ya que era imposible cuantificarlo de manera sencilla. . Para tener una visión más amplia, finalmente también establecimos las afinidades de unión de C-1305 en presencia de los mismos cuatro palíndromos B1-B4 (Tabla 3), que, como se esperaba, resultaron ser notablemente diferentes en comparación con los calculados para Symadex. En los Datos complementarios (Figs. S5-S9) se brindan más detalles sobre los estudios UV-VIS realizados y la descomposición quimiométrica de los espectros resultantes.

Además, también hemos realizado estudios UV-VIS sobre nitroacridinas (C-283 y C-1748) que interactúan con palíndromos cortos de ADNbc. Los resultados (datos no mostrados) han respaldado firmemente la afirmación de que la nitracrina y el C-1748 se unen al ADN de una manera bastante inespecífica. Las constantes de disociación fueron imposibles de determinar, ya que los espectros de los ligandos básicamente permanecieron sin cambios durante la titulación de los palíndromos de ADN.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos tanto para C-1305 como para C-1311 respecto a sus afinidades con los pasos palindrómicos del tetranucleótido NTAN, el 5′-pirimidina-TA-purina-3′ (5′-Pyr-TA-Pu-3′) Las secuencias generalmente parecen estar a favor en comparación con las opciones 5′-Pu-TA-Pyr-3 ′. Entre los primeros, el paso del tetranucleótido 5′-CTAG-3′ fue considerado un compromiso entre su afinidad por las moléculas de ligando y la facilidad de interpretación de sus espectros de RMN. Aunque el octámero palindrómico d(CCCTAGGG)2 (D3) examinado en este documento y durante los estudios previos13 contiene la secuencia CTAG, también incorpora las tríadas CCC/GGG, que resultaron ser muy complicadas de asignar, debido a la severa superposición de resonancias de protones. Al final, mientras que la secuencia D3 sirvió como un buen huésped para la unión del ligando, su descripción espectroscópica fue todo un desafío, especialmente en un estado unido al ligando. Por lo tanto, hemos examinado el octámero d(CGCTAGCG)2 (B2, ver Tabla 3) como una posible 'media dorada', considerando su afinidad por los ligandos de base de acridina y su accesibilidad en términos de asignaciones de RMN 2D.

En el caso de C-1305, el complejo B2:ligando resultante estaba muy bien definido, mientras que el equilibrio en solución entre el estado libre y unido del ADN se desplazó significativamente hacia la formación del complejo (Fig. 4). Los estudios de RMN 2D realizados en el aducto d(CGCTAGCG)2:C-1305 (B2L) han confirmado que una única molécula de ligando se ha intercalado en el centro del octámero B2, produciendo un complejo no covalente con propiedades conformacionales muy similares al los reportados antes13. Éste fue un resultado bienvenido y esperado; Se brindan más detalles sobre esta estructura en la Fig. 5 y la Tabla 4, así como en los Datos complementarios (Tablas S1 y S2, Fig. S4). En particular, las asignaciones a los protones del octámero B2 unido al ligando (Fig. S3) fueron considerablemente más sencillas en comparación con el dúplex D3 (Fig. S2).

Espectros de RMN 1H de: dúplex palindrómico libre d(CGCTAGCG)2, cuyo nombre en código es B2 (A); Dúplex B2 interactuando con C-1311 (B) y dúplex B2 interactuando con C-1305 (C). En todos los casos, la estequiometría de los complejos examinados fue dsDNA/ligando 1:1,5 mol/mol. Los asteriscos rojos marcan los protones imino de los dúplex de ADNbc libres restantes.

La estructura de la cavidad de unión 5′-CTAG-3' con la molécula de ligando incrustada, es decir, el fragmento central del complejo d(CGCTAGCG)2:C-1305 (B2L). Los NOE de ADN/ligando seleccionados se representaron como flechas bidireccionales rojas, junto con los números respectivos correspondientes a las correlaciones enumeradas en la Tabla 4.

Por el contrario, mientras que los estudios UV-VIS en el aducto B2:C-1311 han indicado claramente que un único dúplex B2, como se esperaba, albergaba solo una molécula de Symadex (Fig. S9 y Tabla 3), el examen de RMN de este sistema resultó en los espectros, lo que sugiere que el complejo y el ADN libre estaban de hecho en un equilibrio que exhibía un régimen de intercambio medio (Fig. 4). Esto significa que la escala de tiempo de la formación y la disociación del aducto d(CGCTAGCG)2:C-1311 fueron diferencias de desplazamiento químico entre los estados unidos y libres, lo que produjo una imagen promediada que consta de resonancias muy ampliadas. Al final, el sistema B2:C-1311 no fue sometido a experimentos extensos de RMN 2D, ya que la alteración de las concentraciones totales y relativas tanto del palíndromo B2 como de Symadex no mejoró la imagen de RMN 1H resultante.

Se probaron cuatro bisacridinas (UA) asimétricas: C-2028, C-2041, C-2045 y C-2053 en presencia de secuencias palindrómicas más largas, específicamente diseñadas, que contienen pasos de dinucleótido TA/TA o TG/CA más cercanos a los extremos de los dúplex de ADN (U1 – U4, Tabla S3). Durante estos experimentos, los UA no se intercalaron en absoluto en los oligómeros de ADNbc antes mencionados. Los espectros de RMN 1H resultantes de los complejos dsDNA:UA fueron muy similares a los producidos por los monómeros de nitroacridina (Fig. 6, consulte también la Fig. 2), lo que sugiere interacciones inespecíficas ADN/ligando, presumiblemente en un surco menor de una hélice. Esta observación fue una confirmación de nuestras evaluaciones anteriores, que revelaron que los AU no tuvieron un impacto considerable en los puntos de fusión del dsDNA1. La fuente de este comportamiento, a primera vista inesperado, de las bisacridinas asimétricas requiere una discusión en profundidad.

Espectros de RMN 1H de: dúplex palindrómico libre d(CGTAGCTACG)2, cuyo nombre en código es U2 (A); Dúplex U2 interactuando con C-2045 (B). En todos los casos, la estequiometría de los complejos examinados fue dsDNA/ligando 1:1,5 mol/mol. Los asteriscos rojos marcan los protones imino de los dúplex de ADNbc libres restantes. El U2 no fue analizado mediante espectroscopía de RMN 2D, por lo que los protones imino no fueron marcados.

En este estudio, hemos confirmado que la imidazoacridinona C-1311 (Symadex) es un intercalador de ADNbc basado en acridina eficaz, que elige la secuencia de tetranucleótidos 5′-NTAN-3′ como sitio de unión, siempre que esté disponible. El proceso de intercalación se produce desde el surco menor de la hélice del ADNbc, que es el resultado de la presencia de una cadena lateral de aminoalquilo cargada positivamente, que presumiblemente sirve como anclaje molecular y muestra afinidad por la cadena principal de azúcar-fosfato polianiónico de las cadenas de ADN. El grupo 8-hidroxilo de C-1311 (Fig. 1) es un elemento estructural adicional que estabiliza el complejo resultante, ya que puede formar un enlace de hidrógeno con el átomo de O4' de uno de los restos de desoxirribosa. Los aductos ADN no covalentes formados:C-1311 son relativamente estables, aunque, como han revelado nuestros experimentos, muestran una estabilidad y propiedades espectroscópicas diferentes en comparación con los complejos formados por el primo triazoloacridinona de C-1311, es decir, C-1305. Una de las razones principales de una disparidad notable en las afinidades de unión al ADNbc entre estos dos compuestos muy similares debe provenir de una diferencia estructural importante que exhiben, es decir, la estructura de una cadena lateral de aminoalquilo.

Los espectros NOESY de los distintos complejos ADN:C-1305 estudiados con este fin siempre han mostrado contactos NOE entre los protones de la cadena lateral del ligando y los protones del ADN. Este hecho ha indicado claramente que el resto aminoalquilo de C-1305 exhibía algunas preferencias conformacionales, es decir, era propenso a alinearse a lo largo del esqueleto de azúcar-fosfato de una cadena de ADN. Por el contrario, no se observaron NOE similares durante los estudios espectroscópicos en los aductos ADN:C-1311. Por lo tanto, se concluyó que la cadena lateral de aminoalquilo de Symadex no mostraba ninguna alineación favorecida dentro de un surco menor de los dúplex de ADN. Este resultado se vio reforzado además por los cálculos de modelado molecular de los sistemas examinados. Mientras que en el caso de C-1305 el resto aminoalquilo estaba claramente orientado (durante la mayor parte del tiempo de simulación) de la manera que sugerían los espectros, la cadena lateral de C-1311 no exhibió ninguna agenda conformacional. La fuente de estas diferencias reside en la estructura de ambas mitades. La cadena lateral de C-1305 consta de n-propilo y dos grupos metilo unidos a un nitrógeno terciario, que está cargado positivamente en las condiciones experimentales, mientras que el resto de C-1311 consta de tres grupos etilo unidos a un átomo de nitrógeno similar. Mientras que el primero es mucho más flexible, el segundo está mucho más obstaculizado estéricamente. Además, considerando la posición de los átomos de nitrógeno, la carga positiva ubicada en la cadena lateral de Symadex tiene un rango más bajo, lo que le impide interacciones electrostáticas efectivas con la columna vertebral del ADN polianiónico después de que ocurre la intercalación. Mientras tanto, la carga positiva del resto aminoalquilo de C-1305 tiene un mejor rango y más libertad conformacional, lo que le permite actuar como un segundo anclaje mientras está unido al ADN. El primer anclaje es el enlace de hidrógeno 8-OH-O4' de los ligandos antes mencionados dentro del sitio de intercalación. Aunque tanto C-1305 como C-1311 pueden explotar el anclaje del enlace de hidrógeno después del evento de intercalación, este último se ve efectivamente privado del segundo anclaje, establecido por las interacciones de la cadena lateral. Este anclaje de cadena lateral introduce una estabilidad adicional al aducto no covalente dsDNA:C-1305 resultante. En el caso de Symadex, la cadena lateral cargada positivamente desempeña presumiblemente un papel importante de anclaje sólo en la posible (aún no evidenciada experimentalmente) etapa previa a la intercalación, ayudando durante el asentamiento del ligando dentro de un surco menor del dsDNA. Al final, si bien tanto el C-1305 como el C-1311 son intercaladores muy eficaces, el primero es capaz de crear complejos menos dinámicos que el segundo, debido a la presencia de un factor estabilizador adicional.

Teniendo en cuenta los datos presentados en la Tabla 3, es seguro que las interacciones entre la columna vertebral del ADNbc y la cadena lateral del ligando contribuyen a las constantes de disociación observadas, pero también está bastante claro que el segundo factor que contribuye a la fuerza de las interacciones ADN:ligando es la estructura del sistema de anillos del ligando, ya que C-1305 y C-1311 exhiben estructuras electrónicas un poco diferentes de sus restos aromáticos (Fig. 1). Se podría concluir que, en general, el C-1305 parece crear complejos estructuralmente menos dinámicos, mientras que el C-1311 es un aglutinante ligeramente más fuerte. Sin embargo, las constantes de disociación de ambos ligandos también dependen en gran medida de la secuencia de ADNbc unida, lo que a veces produce resultados inversos. Por ejemplo, C-1305 se une significativamente más fuerte a la secuencia B1 en comparación con C-1311, mientras que en el caso de la secuencia B3 la relación entre C-1305 y C-1311 es idealmente opuesta, mientras que en comparación con las constantes de disociación establecidas para B1 ( Tabla 3). Por lo tanto, aunque podemos relacionar la dinámica estructural de un complejo con la estructura de la cadena lateral, en realidad no podemos asociar las constantes de disociación ADN/ligando únicamente con la estructura de la cadena lateral de un ligando, ya que es una interacción de tres factores: la estructura de la cadena lateral, la estructura del sistema de anillos del ligando y la estructura de la cavidad de unión, es decir, la secuencia del ADN huésped.

Aunque numerosas referencias han sugerido que la nitracrina (C-283) y, en cierta medida, su análogo, C-1748, son intercaladores eficientes de ADNbc7,8,9,10,19,20,21,22, nuestros exámenes no han demostrado esas afirmaciones. . Las nitroacridinas se basan estructuralmente en acridina, un agente intercalante del ADNbc bien establecido23,24, por lo que la suposición sobre su modo de acción de intercalación parecía muy razonable. Sin embargo, el apoyo experimental de esta afirmación se basó en estudios sobre fragmentos más largos de ADN celular digerido que interactúan con nitroacridinas. Los datos obtenidos apuntaron indirectamente a la posibilidad de intercalación, es decir, el punto de fusión del ADNds aumentó ligeramente en presencia de nitroacridinas21, mientras que la nitracrina y sus análogos indujeron el desenrollamiento del ADN superenrollado y la inversión del superenrollamiento, lo cual es un rasgo característico. de agentes intercalantes22. En particular, las 3-nitroacridinas exhibieron interacciones más fuertes con el dsDNA en comparación con las 1-nitroacridinas, es decir, C-283 (nitracrina)21. Se pudo observar una afinidad de unión de ADNbc:nitracrina mucho más pronunciada después de la activación metabólica del fármaco, que se asoció con la reducción de la fracción 1-nitro25,26. Presumiblemente, esto dio como resultado la formación de enlaces covalentes ADN/ligando y el entrecruzamiento del ADN9,10.

Al final, durante nuestros exámenes, no pudimos probar un solo evento de intercalación ni para C-283 ni para C-1748, mientras estudiamos varios octámeros palindrómicos. Incluso el paso TA/TA, que es (teniendo en cuenta las energías acumuladas) el más fácil de "entrar" de los 10 posibles pasos de dinucleótidos27,28, aparentemente no era lo suficientemente atractivo como para crear un complejo de intercalación estable con ninguna de las nitroacridinas discutidas. Aunque hemos observado algunas interacciones dsDNA/nitroacridina, las imágenes resultantes fueron muy diferentes en comparación con las producidas por C-1305 y C-1311. Para estas monoacridinas, los espectros de sus complejos mostraron resonancias tanto de ADN libre como de especies complejas, lo que apunta al lento intercambio de los aductos resultantes con ADN libre y permitió la observación de los contactos ADN/ligando NOE. En el caso de C-283 y C-1748, los espectros revelaron sólo un conjunto de resonancias de ADN, mientras que las resonancias de ligandos no pudieron observarse en absoluto. Aunque los espectros ADN:ligando mostraron, de hecho, la preferencia de las nitroacridinas por ubicarse en el centro de un dúplex D2 dsDNA estudiado, las resonancias de protones registradas no pudieron probar un modo de intercalación de unión ni de la nitracrina ni de su C- 1748 analógico. Nuestra interpretación de los espectros registrados gravita hacia el modo de unión de ADN de ambas moléculas con surcos menores no intercalados, sin embargo, debe afirmarse que no podemos excluir la posibilidad de intercalación, mostrando órdenes de magnitud más altas de ADNds: constante de disociación de ligando en comparación con C-1305 o C-1311. En particular, la afinidad de C-283 (nitracrina) por una secuencia de ADNbc determinada fue considerablemente mayor que la presentada por C-1748. Quizás se podría asociar esta observación con, nuevamente, la estructura de las cadenas laterales de ambas nitroacridinas. En una frase, la cadena lateral de nitracrina es más larga y estaba cargada positivamente en las condiciones experimentales dadas, mientras que la cadena lateral de C-1748 es más corta y termina con un resto hidroxilo, por lo que no estaba cargada en el mismo entorno (Fig. 7).

La desprotonación del átomo de nitrógeno, incrustado en el sistema de anillos de acridina. A un pH inferior a 7, el nitrógeno dentro del resto R2 del C-283 está protonado y cargado positivamente.

La fuente principal de este comportamiento aparentemente inesperado de las nitroacridinas posiblemente se encuentre en la estructura de los sistemas de anillos de ambos compuestos. La primera razón de este aparente motín de intercalación es el hecho de que estas estructuras, es decir, C-283 y C-1748, no son planas. El grupo 9-amino, unido al sistema de anillos, es de hecho un grupo imino, mientras que el protón (originalmente destinado a residir en el resto 9-amino) está ubicado en el átomo de nitrógeno incrustado en el sistema de anillos, lo cual se evidenció claramente. por nuestros estudios previos de RMN6 (Fig. 7). Esto da como resultado dos anillos separados, aromáticos de tipo benceno, dentro de la estructura, mientras que todo el sistema está ligeramente curvado en forma de mariposa, lo que se mostró por primera vez en los estudios cristalográficos con nitracrina29. Además, los átomos de oxígeno del resto 1-nitro tampoco están situados dentro del plano del anillo aromático unido. El grupo –NO2 está notablemente torcido, lo que altera aún más la geometría ya no plana del sistema de anillos. Como resultado, las energías de apilamiento de ADN/ligando, que se espera que contribuyan a la estabilidad de un complejo resultante, en el caso de las nitroacridinas podrían ser simplemente demasiado bajas para forzar una apertura dentro del ADN. Incluso si se está creando la abertura, el complejo de intercalación ADN:nitroacridina resultante parece ser muy inestable. Por lo tanto, se propone (pero no se demuestra de manera inequívoca) la unión al surco menor de un dúplex de ADN como el modo de interacción más razonable que el sistema dsDNA:nitroacridina puede ofrecer, al menos a un pH ~ 6,0 e inferior. En condiciones ligeramente básicas, el sistema de anillos de las nitroacridinas se carga negativamente, lo que reduce notablemente su afinidad por los ácidos nucleicos (fig. 7).

Como se mencionó anteriormente, las bisacridinas (UA) asimétricas constan de dos sistemas de anillos basados en acridina (Fig. 1). Dado que uno de ellos es idéntico al sistema de anillos de C-1311 y considerando el hecho de que C-1311 es un agente de intercalación bastante eficaz, se podría esperar que los UA sean capaces de formar complejos de intercalación al menos "parciales", incluso tomando tenga en cuenta que el segundo sistema de anillos es una copia de nitracrina o C-1748, presumiblemente no intercalante (o posiblemente creando complejos de intercalación inestables). Este último debería poder ubicarse en algún lugar de un surco menor del dsDNA, lo que daría como resultado un modo interesante de unión de los UA a los dúplex de ADN: mitad de intercalación (a través del resto C-1311), mitad de unión a surco menor (a través del conector y resto nitroacridina). Nuestros estudios de RMN han demostrado que este concepto es totalmente erróneo. Mientras que, en teoría, los UA parecen bis-intercaladores perfectos, la realidad es que ni siquiera son medio intercaladores, ya que resultó que la presencia de una fracción aromática de C-1311 no es suficiente para forzar una intercalación. modo para la unión de UA al ADN bicatenario.

Teniendo en cuenta las cuestiones discutidas anteriormente tanto para Symadex como para las nitroacridinas, incluida la nitracrina, finalmente es mucho más fácil explicar por qué las bisacridinas (UA) asimétricas no actúan como intercaladores de ADNbc. La comparación de C-1305 y C-1311 ha puesto de relieve el enorme papel de una cadena lateral de aminoalquilo durante la formación del complejo dsDNA:ligando y su posterior estabilización. En el caso de los AU, con respecto a la posible intercalación, el conector y el resto de nitroacridina deben tratarse como una cadena lateral gigantesca, unida al sistema de anillos de imidazoacridinona. Esta "cadena lateral", aunque esté cargada positivamente, puede ser demasiado grande para interactuar específicamente con la columna vertebral de azúcar y fosfato de las cadenas de ADN, o su estructura podría simplemente desfavorecer esas interacciones. Por lo tanto, como resultado, en esta versión de la historia la cadena lateral sirve como agente desestabilizador después de un posible evento de intercalación. Alternativamente, las interacciones de la cadena lateral dentro del surco menor del ADN pueden prevenir eficazmente la intercalación del resto C-1311 unido. Independientemente de cuál de las afirmaciones anteriores sea verdadera (quizás, en parte, todas sean ciertas), el efecto es el mismo: en ningún caso se observa un evento de intercalación de una molécula de UA en ADNds. Sin embargo, cabe señalar que el intercambio del resto de nitroacridina en un sistema de anillo C-1305 podría dar como resultado la creación de un potente bisintercalador de UA; Más estudios sobre este tema están en camino.

El ADN de doble cadena es sólo una de las varias formas que pueden adoptar los ácidos desoxirribonucleicos. Al final, la falta de interacciones dsDNA/UA, lo que resulta en la falta de impacto de los UA en la estructura y función del dsDNA en un entorno celular, puede considerarse como una ventaja en algunos escenarios farmacológicos. Por otro lado, nuestros estudios preliminares de RMN han sugerido fuertemente que tanto C-1311 como UA exhiben interacciones bien definidas con varios cuádruplex G de ADN, que actualmente se consideran objetivos moleculares muy atractivos en la terapia contra el cáncer. Estos hallazgos están perfectamente en línea con nuestros informes anteriores, que mostraron que los UA inhiben la expresión de K-Ras en las células Panc-1, así como de c-Myc en las células H460. En nuestro trabajo futuro se discutirán estudios avanzados de RMN sobre los complejos G4/UA resultantes y las implicaciones de su formación.

5-Dietilaminoetilamino-8-hidroxiimidazoacridinona (C-1311, Symadex), 5-[[3-(dimetilamino)propil]amino]-8-hidroxi-6H-v-triazolo[4,5,1-de]acridin-6 -ona (C-1305), 9-(2′-hidroxietilamino)-4-metil-1-nitroacridina, (C-1748), 1-nitro-9-[3′-(dimetilamino)propilamino]acridina (C- 283, Ledakrin/Nitracrina), 9-{N-[(imidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-il)aminopropil]-N-metilaminopropilamino}-1′-nitroacridina × 1,5HCl (C-2028), 1-[3-(imidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-il)aminopropil]-4-[3′-(1′-nitroacridin-1- il)-aminopropil]piperazina × 4HCl (C-2041), 9-{N-[(8-hidroxiimidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-il)aminopropil]-N-metilaminopropilamino }-4′-metil-1′-nitroacridina × 3HCl (C-2045), 9-{N-[(imidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-il)aminopropil]- N-metilaminopropilamino}-4′-metil-1′-nitroacridina × 3HCl (C-2053) se sintetizaron en el Departamento de Tecnología Farmacéutica y Bioquímica de la Facultad de Química de la Universidad Tecnológica de Gdansk. Todas las secuencias de ADN se adquirieron en Metabion, GmbH y, además, se purificaron utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra de 2 ml proporcionados por Merck. Este proceso sirvió para eliminar una impureza que daba lugar a señales muy fuertes en los espectros de RMN de protones a aproximadamente 1,28, 1,99, 3,21 y 8,60 ppm (acetato de trietilamina, utilizado por el proveedor de oligos durante la purificación por HPLC).

Cada oligo utilizado en este estudio fue completamente autocomplementario y, por lo tanto, la preparación de las muestras dúplex consistió simplemente en disolver el material purificado en un tampón apropiado. Las condiciones experimentales óptimas, que reducen la tendencia a la autoasociación de las monoacridinas y las bisacridinas asimétricas (UA), mientras se mantienen las formas helicoidales de oligómeros cortos de ADN bicatenario, se seleccionaron como tampón de cacodilato 2,5 mM de pH 5,0, que contenía NaCl 10 mM. Para preparar las muestras de los complejos de intercalación de ADNbc:ligando, se añadió el ligando (monoacridina/UA, ver Fig. 1) a la muestra de RMN premezclada a partir de una solución madre concentrada en agua, para alcanzar la relación molar dúplex:ligando de 0,5, 1,0, 1,25 o 2,0, según la muestra. Los experimentos de titulación se realizaron mediante la adición gradual de soluciones madre concentradas de C-283 o C-1748 a una muestra de ADN; una única porción de ligando correspondía al equivalente molar de 0,1 del dúplex que alberga el ADN.

Todos los espectros de RMN se recogieron utilizando un espectrómetro Bruker Avance III HD de 700 MHz, equipado con un QCI CryoProbe. Después de que se identificaron tres dúplex de ADN de 8 pb que formaban complejos únicos y bien definidos con C-1305 o C-1311 (D2, D3, B2; ver “Resultados”), se registró un conjunto de espectros 2D para la asignación de resonancia para cada uno de los dúplex libres. Comprendía los espectros NOESY (tiempo de mezcla de 150 ms) y TOCSY (tiempo de bloqueo de giro de 60 ms) medidos a 5 °C en 90% H2O/10% D2O, así como el NOESY (tiempo de mezcla de 150 y 400 ms). Espectros HC-HSQC, HP-COSY y DQF-COSY adquiridos en 100% D2O a 5 °C. El proceso de asignación de resonancia en sí se realizó utilizando enfoques estándar31. Para la asignación de los complejos dsDNA/ligando y para la identificación de los picos cruzados ADN-ligando, se registraron los espectros NOESY (tiempo de mezcla de 150 ms), TOCSY (tiempo de bloqueo de giro de 60 ms) y HC-HSQC para los complejos. a 5 °C, tanto en 90% H2O/10% D2O como en 100% D2O.

Se realizaron simulaciones de dinámica molecular (MD) para los complejos de intercalación d(CGATATCG)2:C-1311, d(CCCTAGGG)2:C-1311 yd(CGCTAGCG)2:C-1305 solvatados explícitamente en cajas cúbicas, con ~ 5500 Moléculas de agua TIP3P a una concentración de NaCl de 0,01 M. Los parámetros del campo de fuerza para los octámeros de ADN se tomaron de la última versión del campo de fuerza de ácido nucleico CHARMM3632. Los parámetros para C-1305 y C-1311 se tomaron de la última versión de CHARMM36 Generalized Force Field (CGenFF)33; Las cargas atómicas parciales del ligando se calcularon ab initio utilizando el software GAUSSIAN0934 en el nivel teórico MP2/6-31G*. Todas las minimizaciones de energía y simulaciones de MD se llevaron a cabo utilizando GROMACS 2020.435. Todas las simulaciones de MD se realizaron utilizando el esquema de salto con un paso de tiempo de 2 fs. La técnica de malla de partículas de Ewald con un corte de 1 nm y una separación de rejilla de aprox. Se utilizó 0,1 nm para evaluar las fuerzas electrostáticas36. Las interacciones de van der Waals se calcularon utilizando el potencial de Lennard-Jones con un límite de 1 nm. Las simulaciones se realizaron a una temperatura constante de 278 K y a una presión constante de 1 bar, utilizando el método de acoplamiento débil37.

Después de obtener la forma B inicial de los dúplex de ADN de X3DNA 2.338, se colocó una molécula C-1305 o C-1311 con un nitrógeno terciario protonado al final de la cadena lateral en una proximidad moderada de un dúplex de ADN respectivo utilizando el software VMD39. Después de la minimización de energía adecuada y 100 ns de equilibrio inicial basado en MD con restricciones de posición establecidas en el ADN y la molécula del ligando, cada sistema se simuló durante 1 ns. Durante esta ejecución, se aplicaron restricciones de distancia correspondientes a los contactos NOE entre los protones aromáticos del ligando y los protones del ADN (Tablas 2 y 4). Esto se hizo utilizando la implementación GROMACS del potencial de restricción que agrega una penalización cuadrática al potencial cuando una distancia excede un umbral inferior o superior (consulte la Tabla S4 en los Datos complementarios). Se utilizaron las mismas constantes de fuerza de 1000 kJ mol-1 nm-2 para todas las distancias restringidas correspondientes a los contactos intermoleculares ADN/ligando. Las simulaciones descritas anteriormente dieron como resultado una intercalación impulsada por DR de moléculas de ligando en el sitio 5′-TA-3'/5′-TA-3' desde el surco menor de los dúplex de ADN. Posteriormente, se extrajo el fotograma final de cada trayectoria resultante. Estos marcos se establecieron como puntos de partida para simulaciones MD de 1 µs de duración que se describen a continuación, que fueron precedidas por 100 ns de equilibrio adicional con restricciones de posición establecidas en el ADN y las moléculas de ligando.

Durante esta ejecución, los sistemas fueron sujetos a 19 (D2L y D3L) y 23 (B2L) restricciones de distancia derivadas del experimento NOESY de τm = 150 ms y otras 14 (D2L) y 16 (D3L, B2L) restricciones de distancia, fortaleciendo la Enlaces de hidrógeno en pares de bases Watson-Crick. Todos los pares de bases se estabilizaron excepto los pares terminales G≡C, ya que no se observó resonancia del protón imino G8 en los espectros de RMN 1H de ninguno de los complejos estudiados. La constante de la fuerza de restricción de distancia también fue igual a 1000 kJ mol-1 nm-2.

El análisis de conglomerados se realizó utilizando el método Daura40 con un límite de RMSD establecido en 0,2 nm.

Se prepararon soluciones 0,01 mM de C-1311 y C-1305 y las soluciones de ADN se agregaron en porciones para obtener las siguientes raciones: 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5, 7 ADN con respecto a C-1311. y C-1305. La concentración de ligando se mantuvo constante. Después de cada adición, se recogieron los espectros UV-VIS en una cubeta de cuarzo con una longitud de camino óptico de 1 cm.

Todos los conjuntos de espectros se organizaron en matrices y se centraron. Posteriormente, las matrices de datos se han sometido a una descomposición numérica en vectores propios, utilizando un algoritmo de análisis de componentes principales dobles (PCA). Para preparar gráficos de Scatchard se utilizaron fracciones molares de formas particulares, calculadas en función de vectores propios seleccionados. Las constantes de disociación se determinaron basándose en el diagrama de Scatchard mediante regresión por partes.

El gráfico de Scatchard se expresó en función de ν/L frente a v. Siempre que v fuera igual a n (número de sitios de unión idénticos e independientes); n, L y M se calcularon a partir de fracciones molares previamente determinadas según la ecuación. (1):

donde: v - ocupación promedio del huésped de ADN por molécula de ligando; M: concentración total de ADN; c-concentración total de ligando; L: concentración de ligando libre.

La mayoría de los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de datos complementarios). Los espectros completos de RMN 2D y las trayectorias MD generadas y analizadas durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Paluszkiewicz, E. et al. Diseño, síntesis y alto potencial antitumoral de nuevos derivados asimétricos de bisacridina frente a tumores sólidos humanos, específicamente cánceres de páncreas y su capacidad única para estabilizar los cuádruplex G del ADN. EUR. J. Med. Química. 204, 112599 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kulesza, J., Pawłowska, M. y Augustin, E. La influencia de las bisacridinas antitumorales asimétricas en el crecimiento y la viabilidad de los esferoides cancerosos 3D. Moléculas 26, 6262 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pilch, J. y col. Los nuevos derivados asimétricos de bisacridina unidos de forma no covalente a puntos cuánticos cuaternarios mejoran la terapia contra el cáncer al aumentar la citotoxicidad hacia las células cancerosas y proteger las células normales. Aplicación ACS. Madre. Interfaces 12, 17276–17289 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pilch, J., Kowalik, P., Bujak, P., Nowicka, AM y Augustin, E. Puntos cuánticos como buenos portadores de bisacridinas asimétricas para modular la captación celular y la respuesta biológica en células de cáncer de pulmón y colon. Nanomateriales 11, 462 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pilch, J. y col. Nanoplataformas de administración de fármacos que responden al pH como portadores inteligentes de bisacridinas asimétricas para la terapia dirigida contra el cáncer. Farmacéutica 15, 201 (2023).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kosno, M. et al. Equilibrio ácido-base y autoasociación en relación con la alta actividad antitumoral de bisacridinas asimétricas seleccionadas establecidas mediante análisis quimiométrico extenso. Moléculas 27, 3995 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gniazdowski, M., Ciesielska, E. & Szmigiero, L. Algunas propiedades de los complejos irreversibles de nitracrina (Ledakrin, C-283) con polinucleótidos. Química. Biol. Interactuar. 34, 355–366 (1981).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Szostek, A., Wysocka-Skrzela, B., Tiwari, RK y Konopa, J. Reticulación entre cadenas de ADN en células tumorales mediante un nuevo grupo de 1-nitroacridinas antitumorales. En t. J. Cáncer 13, 441 (2002).

Google Académico

Pawlak, K., Pawlak, JW y Konopa, J. Actividad citotóxica y antitumoral de las 1-nitroacridinas como efecto secundario del entrecruzamiento del ADN entre cadenas. Res. Cáncer. 44, 4289–4296 (1984).

CAS PubMed Google Académico

Konopa, J., Pawlak, JW y Pawlak, K. El modo de acción de las 1-nitroacridinas citotóxicas y antitumorales. III. Entrecruzamiento in vivo entre cadenas de ADN de células de mamíferos o bacterias mediante 1-nitroacridinas. Química. Biol. Interactuar. 43, 175-197 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Laskowski, T., Czub, J., Sowiński, P. y Mazerski, J. Complejo de intercalación de imidazoacridinona C-1311, un posible fármaco anticancerígeno, con hélice de ADN d (CGATCG) 2: estudios estereoestructurales mediante espectroscopia de RMN 2D. J. Biomol. Estructura. Din. 34, 653–663 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Laskowski, T., Borzyszkowska, J., Grynda, J. & Mazerski, J. C-1311 (Symadex), un posible fármaco anticancerígeno, se intercala en el ADN entre los restos A y G. Estereoestructura derivada de RMN y refinada por MD del complejo d (GAGGCCTC) 2: C-1311. J. Mol. Estructura. 1141, 357–367 (2017).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Laskowski, T. y col. Se descubrió una fuerte preferencia por el paso de dinucleótido TA/TA para un potente intercalador de ADNbc antitumoral basado en acridina, C-1305: estudios estructurales y de especificidad de secuencia basados en RMN. Ciencia. Rep. 10, 11697 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baruah, H. & Bierbach, U. Intercalación inusual de acridin-9-iltiourea en el paso de base de ADN 5′-GA / TC desde el surco menor: implicaciones para el perfil de aducto de ADN covalente de un nuevo conjugado de platino-intercalador. Ácidos nucleicos res. 31, 4138–4146 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Slator, C. y col. Los metalofármacos de di-cobre promueven la quimioterapia NCI-60 a través de la producción de oxígeno singlete y superóxido con discriminación de oligonucleótidos TA/TA y AT/AT en tándem. Ácidos nucleicos res. 46, 1-18 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Niyazi, H. y col. Las estructuras cristalinas de λ-[Ru(phen)2d ppz]2+ con oligonucleótidos que contienen pasos TA/TA y AT/AT muestran dos modos de intercalación. Nat. Química. 4, 621–628 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tippin, DB y Sundaralingam, M. Estructura de d(CCCTAGGG): la comparación con nueve secuencias de octámeros isomorfos revela cuatro patrones distintos de interacciones intermoleculares dependientes de secuencias. Acta Crystallogr. D Biol. Cristalogr. 52, 997–1003 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fabian, H., Hölzer, W., Heinemann, U., Sklenar, H. & Welfle, H. Conformación de d(GGGATCCC)2 en cristales y en solución estudiada mediante difracción de rayos X, espectroscopia Raman y modelado molecular. Ácidos nucleicos res. 21, 569–576 (1993).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stallings, WC y cols. Modelo de intercalación para el entrecruzamiento del ADN en un derivado de 1-nitro-9-aminoacridina, un análogo del agente antitumoral “ledakrin” (nitracrina). J. Biomol. Estructura. Din. 2, 511–524 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gniazdowski, M. & Szmigiero, L. Nitracrina y sus congéneres: descripción general. General Farmacol. Vasc. Sistema. 26, 473–481 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Pawlak, K., Matuszkiewicz, A., Pawlak, JW y Konopa, J. El modo de acción de las 1-nitroacridinas citotóxicas y antitumorales. I. Las 1-nitroacridinas no ejercen sus efectos citotóxicos mediante unión fisicoquímica con el ADN. Química. Biol. Interactuar. 43, 131-149 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Filipski, J., Marczyński, B., Sadzińska, L., Chalupka, G. y Chorazy, M. Interacciones de algunos nitroderivados de 9-aminoacridina sustituida con ADN. Biochim. Biofísica. Actas 478, 33–43 (1977).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lerman, LS La estructura del complejo ADN-acridina. Bioquímica 49, 94-102 (1963).

CAS Google Académico

Nafisi, S., Saboury, AA, Keramat, N., Neault, J.-F. y Tajmir-Riahi, H.-A. Estabilidad y características estructurales de la intercalación de ADN con bromuro de etidio, naranja de acridina y azul de metileno. J. Mol. Estructura. 827, 35–43 (2007).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Pawlak, JW, Pawlak, K. y Konopa, J. El modo de acción de las 1-nitroacridinas citotóxicas y antitumorales. II. Unión covalente mediada por enzimas in vivo de un derivado de 1-nitroacridina, ledakrina o nitracrina, con ADN y otras macromoléculas de células de mamíferos o bacterianas. Química. Biol. Interactuar. 43, 151-173 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gorlewska, K., Mazerska, Z., Sowiński, P. & Konopa, J. Productos de activación metabólica del fármaco antitumoral Ledacrine (Nitracrine) in vitro. Química. Res. Toxico. 14, 1-10 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

SantaLucia, J. Una visión unificada de la termodinámica del vecino más cercano del ADN de polímeros, mancuernas y oligonucleótidos. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. 95, 1460-1465 (1998).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Protozanova, E., Yakovchuk, P. y Frank-Kamenetskii, MD Equilibrio apilado-no apilado en el sitio de la mella del ADN. J. Mol. Biol. 342, 775–785 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dauter, Z., Bogucka-Ledóchowska, M., Hempel, A., Ledóchowski, A. y Kosturkiewicz, Z. Estructura cristalina y molecular del monoyoduro de l-nitro-9-(3-dimetilaminopropilamino)-acridina (C-283) . Año. Química. 49, 859–861 (1975).

CAS Google Académico

Pawłowska, M., Kulesza, J. & Augustin, E. El nivel de proteína c-Myc afectado por bisacridinas asimétricas influye en la apoptosis y la senescencia inducidas en células de cáncer colorrectal HCT116 y de pulmón H460. En t. J. Mol. Ciencia. 23, 3061 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wijmenga, SS y van Buuren, BNM El uso de métodos de RMN para estudios conformacionales de ácidos nucleicos. Prog. Espectrosc de RMN. 32, 287–387 (1998).

Artículo CAS Google Scholar

Foloppe, N. y MacKerell, AD Jr. Campo de fuerza empírico de todos los átomos para ácidos nucleicos: I. Optimización de parámetros basada en datos objetivo macromoleculares de fase condensada y moléculas pequeñas. J. Computación. Química. 21, 86-104 (2000).

3.0.CO;2-G" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-987X%2820000130%2921%3A2%3C86%3A%3AAID-JCC2%3E3.0.CO%3B2-G" aria-label="Article reference 32" data-doi="10.1002/(SICI)1096-987X(20000130)21:23.0.CO;2-G">Artículo CAS Google Scholar

Vanommeslaeghe, K. et al. Campo de fuerza general de CHARMM: un campo de fuerza para moléculas similares a fármacos compatibles con los campos de fuerza biológicos aditivos de todos los átomos de CHARMM. J. Computación. Química. 31, 671–690 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Frisch, MJ y cols. 09, Revisión D.01 (Gaussian Inc., 2013).

Google Académico

Abraham, MJ y cols. GROMACS: Simulaciones moleculares de alto rendimiento mediante paralelismo multinivel desde portátiles hasta supercomputadoras. SoftwareX 1–2, 19–25 (2015).

ADS del artículo Google Scholar

Darden, T., York, D. y Pedersen, L. Malla de partículas Ewald: un método N⋅log(N) para sumas de Ewald en sistemas grandes. J. química. Física. 98, 10089 (1993).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Berendsen, HJC, Postma, JPM, van Gunsteren, WF, Dinola, A. & Haak, JR Dinámica molecular con acoplamiento a un baño externo. J. química. Física. 81, 3684–3690 (1984).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Lu, X. & Olson, WK 3DNA: un paquete de software para el análisis, reconstrucción y visualización de estructuras tridimensionales de ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos res. 31, 5108–5121 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Humphrey, W., Dalke, A. y Schulten, KVMD Dinámica molecular visual. J. Mol. Grafico. 14, 33–38 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Daura, X. et al. Plegado de péptidos: cuando la simulación se encuentra con el experimento. Angélica. Química. En t. Ed. 38, 236–240 (1999).

3.0.CO;2-M" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-3773%2819990115%2938%3A1%2F2%3C236%3A%3AAID-ANIE236%3E3.0.CO%3B2-M" aria-label="Article reference 40" data-doi="10.1002/(SICI)1521-3773(19990115)38:1/23.0.CO;2-M">Artículo CAS Google Scholar

Descargar referencias

Los autores desean agradecer al profesor Jan Mazerski (Departamento de Tecnología Farmacéutica y Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Tecnológica de Gdańsk, Gdańsk, Polonia) por su apoyo y ayuda sustancial en los análisis quimiométricos. Este trabajo fue financiado por una subvención del Centro Nacional de Ciencias de Polonia no. 2019/33/B/NZ7/02534. También se recibió apoyo financiero de la subvención del Centro Nacional de Ciencias de Polonia no. 2017/01/X/NZ7/00752. Esta investigación fue apoyada en parte por la infraestructura PLGrid. TASK (Gdańsk) también proporcionó recursos computacionales.

Departamento de Tecnología Farmacéutica y Bioquímica y Centro BioTechMed, Facultad de Química, Universidad Tecnológica de Gdańsk, Gabriela Narutowicza Str. 11/12, 80-233, Gdansk, Polonia

Tomasz Laskowski, Michał Kosno, Joanna E. Frackowiak, Julia Borzyszkowska-Bukowska, Paweł Szczeblewski, Nikola Radoń, Maria Świerżewska, Ewa Paluszkiewicz y Zofia Mazerska

Instituto de Química Bioorgánica, Academia Polaca de Ciencias, Zygmunta Noskowski Str. 12/14, 61-704, Poznań, Polonia

Witold Andrałojć

Facultad de Física Aplicada y Matemáticas, Universidad Tecnológica de Gdańsk, Gabriela Narutowicza Str. 11/12, 80-233, Gdansk, Polonia

Anna Woźny

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

TL y MK concibieron los experimentos, TL, MK, WA y JEF realizaron los experimentos, TL, MK, WA, JB-B., PS, NR, M.Ś. y AW analizaron los resultados, EP sintetizó los compuestos estudiados, TL, MK, WA, JEF y ZM escribieron el manuscrito principal, TL preparó las Figs. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Todos los autores han revisado el manuscrito.

Correspondencia a Tomasz Laskowski.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Laskowski, T., Kosno, M., Andrałojć, W. et al. Las interacciones de acridinas monoméricas y bisacridinas (UA) asimétricas con dúplex de ADN: una visión proporcionada por estudios de RMN y MD. Representante científico 13, 3431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30587-y

Descargar cita

Recibido: 02 de diciembre de 2022

Aceptado: 27 de febrero de 2023

Publicado: 01 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30587-y

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.

Blog

Las interacciones de acridinas monoméricas y bisacridinas (UA) asimétricas con dúplex de ADN: una visión proporcionada por estudios de RMN y MD